Damit es zur eigentlichen Fertilisation (Befruchtung) kommt, müssen die Spermien des Mannes viele Hindernisse überwinden, um zum Eilleiter zu gelangen.
Bereits das saure Milieu in der Scheide verringert die anfangs im Ejakulat vorhandenen 300-500 Millionen Spermien auf 300 000.
Erst im Gebärmutterhals (Zerviks) finden sich bessere Bedingungen für die Spermatozoon vor, da dort wie im Ejakulat ein alkalisches Milieu vorherrscht. Förderlich für die weitere Fortbewegung der Spermien sind die längsgerichteten Fäden im Zervikalschleim. Spermien mit Fehlbildungen bleiben in diesem Gitterwerk von Fäden hängen.
Ein weiterer Teil der Spermien wird in Einbuchtungen (Krypten) der Zervikalkanals zwischengespeichert und später langsam wieder freigegeben. In der Gebärmutterschleimhaut werden weitere Spermien aussortiert, sodass im Bereich des Tubus (Eileiters) etwa 500-800 Spermien übrigbleiben.
Während die Spermien ihren Weg im weiblichen Genitaltrakt zurücklegen, durchlaufen sie den letzen Schritt ihrer Reifung (Kapazitation). Dabei werden die spaltenden Enzyme im Spermienkopf im Bereich des Akrosoms aktiviert, um die Eizelle von außen zu durchdringen.
Gelingt es einer von vielen hunderten Spermien die Eizelle mit ihren zwei Hüllen vollständig zu durchdringen, bleibt den anderen Spermien der Weg ins Eizellinnere versperrt. Die kortikale Reaktion der Eizelle bewirkt die Verhärtung der Außenschicht und beugt somit einer Polyspermie vor. Ein mehrfaches Eindringen von Spermien führt zu nicht lebensfähigen Eizellen.

Sobald die Zellmembranen der beiden Keimzellen miteinander verschmelzen, bilden sich im Spermium und der Eizelle die Vorkerne (Pronukleus) mit den haploiden Ein-Chromatid-Chromosomen aus.
Während die sekundäre Oozyte ihre 2.Reifeteilung beendet, wandelt sich das Spermium durch Trennung vom Spermienschwanz zum Pronukleus um. Das Zusammentreten von beiden haploiden Kernen bezeichnet man als Konjugation. Der aus der Konjugation entstandene Kern ist die Zygote.