Vor jeder Darmspiegelung muss der Darm des Patienten gereinigt werden, um für den Untersucher optimale Sichtverhältnisse während des Eingriffs zu schaffen. Aus diesem Grund muss der Patient vor einer Darmspiegelung medikamentös abführende Maßnahmen über sich ergehen lassen. Einen Tag vor der Untersuchung muss der Patient meistens Wasser mit darin gelöstem Movicol oder ähnlichen Präparate trinken, die abführend wirken.

Des Weiteren sollte er vor der Untersuchung nicht mehr essen. Die Darmspieglung erfolgt selten auf der Krankenhausstation, sondern meistens in dafür vorgesehene endoskopische Abteilungen, die fast jedes Krankenhaus besitzt. Der Patient wird kurz vor dem Eingriff liegend auf die Seite gelagert. Des Weiteren bekommt er einen venösen Zugang gelegt (Braunüle), durch den eine Kurznarkose oder, wenn Komplikationen auftreten, lebensrettende Medikamente direkt in die Vene appliziert werden können.

Als Schlafmittel wird meistens Propofol in niedriger Dosierung bei einer Darmspiegelung verwendet. Der Patient schläft daraufhin ein. Mit Hilfe eines an dem Finger befestigten Pulsoxymeters können Herzfrequenz und Sauerstoffsättigung des Patienten während des Eingriffs überwacht werden. Der Untersucher, meistens zusätzlich bekleidet mit einer Plastikschürze, führt das biegsame Koloskop, nach eingehender Prüfung in den After des Patienten ein.
Mit an dem Griff befestigte Tasten kann das Koloskop an seiner Spitze ähnlich eines Schlangenkopfes in alle Richtungen gedreht werden. Kurz nach dem Einführen des Koloskops wird bei einer Darmspiegelung Luft in den Darm geleitet. Grund dafür ist, dass der Darm die Eigenschaft hat, sich in geleertem Zustand zusammenzufalten und so die Sichtverhältnisse sehr schlecht wirken zu lassen. Mit Hilfe der Luft wird der Darm entfaltet. Einige Patienten, die keine Kurznarkose vor dem Eingriff erhalten wollen, bezeichnen das Lufteinlassen als unangenehm bis schmerzhaft.

Der Untersucher schiebt nun Stück für Stück das Koloskop nach vorne. Dabei gilt das Augenmerk zunächst nicht auf die Begutachtung des Darmes, sondern auf die sorgfältige Manövrierung des Endoskops durch den Darm. Wichtig ist, dass die Darmwand bei einer Darmspiegelung nicht verletzt wird. Verengte Stellen werden durch Erhöhung des Lufteinlasses geöffnet. Mit Hilfe der Kamera und der sehr starken Lampe wird das aktuelle Bild auf einen Monitor neben dem Untersucher projiziert. Die Beweglichkeit an der Spitze des Koloskop hilft allerdings nur dabei die Kameraeinstellung entsprechend zu ändern, zur Fortbewegung des Koloskops wird das Geschick des Untersuchers benötigt. Von außen kann er durch links und rechts Bewegungen das Untersuchungsgerät so manövrieren, dass es bis zum Übergang von Dünndarm zum Dickdarm vorgeschoben wird.

Dabei muss es eine Strecke von ca. 1.50 m zurücklegen. An der sogenannten Baumannschen Klappe (Übergang von Dünndarm zu Dickdarm) wird meistens das Vorschiebemannöver beendet. Von nun an wird das Koloskop langsam wieder zurückgezogen, die eigentliche Darmspiegelung beginnt. Die Darmwände werden inspiziert, Rötungen, Schwellungen und Belege begutachtet. An auffälligen Stellen kann von außen ein Draht bis zur  Koloskop Spitze vorgeschoben werden.

An der Spitze des Drahtes befindet sich eine kleine Zange. Mit dieser Zange kann der Untersucher verdächtige Stellen der Darmwand greifen, von außen zuziehen und nach draußen befördern.
Die auch als Biopsie bezeichneten Gewebeproben werden dann zur pathologischen Begutachtung in die Pathologie geschickt. Neben dem Livebild ist es auch möglich mit der Kamera Fotos aufzunehmen. Jede verdächtige Stelle muss bei einer Darmspiegelung fototechnisch dokumentiert werden, um später den Untersuchungsvorgang nachvollziehen zu können.
Neben der einbringbaren Zange können auch Schlingen über das Endoskop in den Darm eingebracht werden, mit denen z.B. Polypen, die sich häufig an den Darmwänden befinden, umschlungen und abgetragen werden können. Erreicht der Untersucher wieder den Darmausgang wird das Gerät herausgezogen und desinfiziert. Der Patient verbleibt meistens noch kurze Zeit später in einem schlafenden oder dämmernden Zustand und wird wieder auf Station gebracht.