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Am reichlichsten findet sich Folsäure in pflanzlichen Stoffen wie Spinat, Spargel Blattsalaten und Getreide, sowie in tierischer Leber.  Es besteht aus drei Bausteinen: Pteridinsäure, Benzoesäure und Glutamat.
Vitamin B9 ist weiterhin enthalten in: Rote Bete, Brocolli, Karotten, Spargel Rosenkohl, Eigelb, Tomaten und Nüssen

Bevor Folsäure (Vitamin B9) seine Funktionen im Körper erfüllen kann, muss es aktiviert werden. Dies geschieht mithilfe der (Dihydro)folatreduktase, die es zum aktiven Tetrahydrofolat (also Folsäure + vier H-Atome) wandelt. Nach seiner Aktivierung dient Tetrahydrofolat (FH4) als Überträger von C1-Gruppen, das heißt von jeweils einem C-Atom, an dem verschiedene Substituenten hängen können. So z.B. CH4 oder CH3OH. Besonders wichtig ist Tetrahydrofolat bei der Synthese von dTMP (Desoxy-Thymidinmonophosphat), einem Baustein für die DNA-Synthese. Diese Reaktion ist klinisch sehr relevant, da sie auch von Tumorzellen durchlaufen wird, damit diese ihr genetisches Material replizieren können. In der Tumortherapie setzt man deshalb sogenannte Dihydrofolatreduktase-Hemmer ein, die – wie der Name bereits andeutet – die Funktion der Dihydrofolatreduktase so weit einschränken, dass diese nicht mehr in der Lage ist, Folsäure (Vitamin B9) zu Tetrahydrofolat zu aktivieren. So kann beispielsweise dTMP, der DNA-Baustein, nicht mehr hergestellt und die DNA somit nicht mehr verdoppelt werden, was zu einer Arretierung des Wachstums der betroffenen Zellen führt. Diese hemmenden Medikamente wirken also zytostatisch (das Wachstum von Tumorzellen hemmend). Methotrexat ist eines dieser Medikamente.

Auch in den bakteriellen Stoffwechsel kann – was die Folsäure betrifft – klinisch eingegriffen werden. Bakterien können – im Gegensatz zum Menschen – Folsäure/ Vitamin B9 selbst synthetisieren. Das macht sich der Mensch zu deren Bekämpfung zunutze, in dem er mithilfe von Sulfonamiden diese Synthese der Folsäure hemmt. Dies hemmt die Vermehrung der Bakterien. Sulfonamide dienen so als Medikamente zur antibiotischen Therapie.